荧光显微镜是利用- -个高发光效率的点光源,经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后,再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下,即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高,主要用于细胞结构和功能以及化学成

分等的研究。荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、 激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。

荧光光源一- 般采用超高压汞灯(50- -00)0 ，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一-个产生 较强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片(-般有紫

外、紫色、蓝色和绿色激发滤片)，仅使一定波长的激发光透过照射到标本.上,而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在较短时间内发射出较照射波

长更长的可见荧光。荧光具有专- -性，一 般都比激发光弱 ,为能观察到专- -的茨光, 在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。它的作用有二:-是吸收和阻挡激发

光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛,二是选择并让特异的荧光透过，表现出专- -的荧光色彩 。两种滤光片必须选择配合使用。荧光显微镜就其光路来分有两种:

1.透射式荧光显微镜:

激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器,也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上.这是比较旧式的荧光显

微镜。其优点是低倍镜时荧光强,而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱.所以对观察较大的标本材料较好。

2.落射式荧光显微镜

这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面,即用同一-物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加_上一-个双色束分离器，它与光铀呈45。角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜,反回到双色束分离器,使激发光和荧光分开,残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片/双色束分离器/阻断滤片的组合插块,可满足不同荧光反应

产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰,放大倍数愈大荧光愈强。

(二)荧光显微镜使用方法

1.打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到较亮点。

2.透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片/双色束分离器/阻断滤片的插块。

3.用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。

4.放置标本片,调焦后即可观察。使用中应注意:末装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤;用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊油镜;高压汞灯

关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。

(三)观察在示教台.上的荧光显微镜下用蓝紫光滤光片，可见经o. 01%的丫啶橙荧光染料染色的细胞，细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光(暗绿色和橙红色)。